-

从样本到发刊：UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS与网络药理学联合研究标准化操作手册

2025-12-10

UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS与网络药理学联合研究标准化操作手册

—— 从方案规划到论文发表的全流程可复现方案


本文将系统拆解UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS高分辨质谱技术与网络药理学的交叉应用路径，为中药及天然产物的药效物质基础阐释与作用机制研究提供标准化操作规范。该联合研究流程已通过多项高水平科研实践验证，具有极强的实操性与结果可重复性。




全流程分步实施指南


b611f700ddef8cca99e7161382ba4c40.jpg



01

实验规划与样品制备（耗时1-2周）





1.1 明确研究目标

  • 锁定核心科研问题：确定拟研究的中药/天然产物及其治疗的对应疾病类别

  • 建立研究假设：通过文献调研提出可能的作用机制推测

  • 界定研究范围：聚焦核心研究方向（例如特定活性成分、关键作用靶点、核心信号通路等）


1.2 筹备实验材料：关键材料清单

  • 药材/样品：经权威机构鉴定的药材样本，同时留存凭证标本

  • 化学试剂：UPLC级甲醇、乙腈、甲酸；分析纯提取试剂

  • 标准品：已知结构的化合物标准品（用于质谱鉴定参考）

  • 细胞/动物模型：与研究疾病相关的细胞系或模式动物

  • 数据库访问权限：确保能够正常使用所需的化学与生物学数据库



1.3 样品处理步骤

  • 样品粉碎：干燥药材粉碎后过筛（常用40-60目）

  • 提取工艺优化：

  1. 筛选提取溶剂（甲醇、乙醇、水及不同比例的混合溶剂）

  2. 优化提取手段（超声提取、回流提取、索氏提取等方式）

  3. 确定最佳提取时间、温度及料液配比

  • 样品前处理：

  1. 提取液经0.22μm滤膜过滤处理

  2. 依据需求进行浓缩与复溶操作

  3. 质谱检测前进行适当稀释处理



02

UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS检测分析

（耗时2-3周）





2.1 仪器参数调试

常规UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS工作参数设置：

色谱参数

具体配置

色谱柱

Thermo Hypersil GOLD C₁₈ (100×2.1 mm, 1.9 μm)

柱温

30-40°C

流动相

A相：乙腈（含0.1%甲酸）；B相：水（含0.1%甲酸）

梯度洗脱程序

0-5 min: A相5%-30%；5-15 min: A相30%-60%；15-25 min: A相60%-95%；25-30 min: A相95%

流速

0.3 mL/min

进样量

2-5 μL

质谱参数

正离子模式

负离子模式

离子源

HESI（加热电喷雾离子源）

HESI（加热电喷雾离子源）

喷雾电压

3.5 kV

3.0 kV

毛细管温度

320°C

320°C

辅助气温度

350°C

350°C

鞘气流速

35 arb

35 arb

辅助气流速

10 arb

10 arb

扫描范围

m/z 100-1500

m/z 100-1500

分辨率

全扫描：70,000 FWHM；二级扫描：17,500 FWHM

全扫描：70,000 FWHM；二级扫描：17,500 FWHM

碰撞能量

阶梯NCE：20、40、60 eV

阶梯NCE：20、40、60 eV

扫描模式

Full MS/dd-MS²（数据依赖采集模式）

Full MS/dd-MS²（数据依赖采集模式）


2.2 数据采集要求

  • 方法验证：

  1. 开展系统适用性测试

  2. 检查色谱峰形、分离效果及质谱响应强度

  • 样品分析：

  1. 采用随机进样方式，减少系统误差

  2. 每分析10个样品插入1个QC样本（混合样本）

  3. 30定期运行空白样本以排查污染问题

  • 数据质量控制：

  1. 监控基峰离子流图（BPI）的稳定性

  2. 检查质量精度（一般要求误差控制在合理范围）

  3. 评价色谱峰保留时间的重现性


2.3 化合物鉴定步骤

  • 一级质谱数据提取：

  1. 利用Xcalibur、Compound Discoverer等软件工具

  2. 提取精确分子量并推断元素组成

  • 二级质谱解析：

  1. 分析特征碎片离子信息

  2. 推测可能的裂解途径

  • 化合物鉴定方法：

鉴定流程：质谱数据采集 → 精确质量数测定 → 元素组成推断 → 数据库检索 → 标准品比对 → 结构确认

数据库支持：ChemSpider、PubChem及文献比对；mzCloud/MassBank、Metlin/HMDB及自建数据库

  • 鉴定置信度等级：

Level 1：标准品比对（保留时间与质谱数据完全一致）

Level 2：文献/数据库比对（质谱数据匹配，无标准品验证）

Level 3：结构推定（根据质谱裂解规律推导）

Level 4：未知化合物（仅确定分子式）



03

网络药理学分析（耗时2-3周）





3.1 活性成分筛选

  • ADME参数筛选：

  1. 口服生物利用度（OB）≥30%

  2. 类药性（DL）≥0.18

  3. 运用SwissADME、pkCSM等在线工具进行筛选

  • 活性成分确认：

  1. 结合文献报道的生物活性数据

  2. 参考成分在样品中的相对含量情况


3.2 靶点预测与收集

靶点预测工具及相关数据库：

工具/数据库

官方网址

核心功能

SwissTargetPrediction

http://www.swisstargetprediction.ch

基于结构相似性的靶点预测

PharmMapper

http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper

药效团匹配型靶点预测

SEA

https://sea.bkslab.org

配体相似性导向的靶点预测

STITCH

http://stitch.embl.de

化合物-蛋白质相互作用预测

TargetNet

http://targetnet.scbdd.com

机器学习驱动的靶点预测


3.3 疾病靶点收集

核心数据库信息表：

数据库名称

官方网址

数据库功能

GeneCards

https://www.genecards.org

综合基因信息数据库

OMIM

https://omim.org

遗传性疾病专门数据库

DisGeNET

https://www.disgenet.org

疾病-基因关联数据库

TTD

http://db.idrblab.net/ttd

治疗靶点专门数据库

CTD

http://ctdbase.org

比较毒物基因组学数据库

  • 靶点筛选准则：

  1. 去除重复靶点信息

  2. 统一基因命名（采用官方标准符号）

  3. 限定物种为“Homo sapiens”（人类）


3.4 网络构建与分析

  • 维恩图分析：获取化合物靶点与疾病靶点的交集靶点

  • 蛋白互作网络构建：

  1. 借助STRING数据库（https://string-db.org）

  2. 设置置信度阈值＞0.7

  3. 导出TSV格式原始数据

  • 网络可视化与分析：

  1. 使用Cytoscape软件（3.9.0及以上版本）

  2. 安装必要插件（NetworkAnalyzer、MCODE、CytoHubba等）

  3. 计算网络拓扑参数（度值、介数中心性、紧密度中心性等）

  • 核心靶点筛选准则：

  1. 度值（Degree）≥2倍中位数

  2. 介数中心性（Betweenness）处于较高水平

  3. 紧密度中心性（Closeness）处于较高水平


3.5 通路富集分析

核心分析工具：

分析工具/软件

官方网址

核心功能

DAVID

https://david.ncifcrf.gov

功能注释与富集分析平台

Metascape

https://metascape.org

一站式生物功能分析系统

KOBAS

http://kobas.cbi.pku.edu.cn

通路富集专门分析工具

clusterProfiler

R语言包（无独立官方网址，可通过CRAN获取）

生物功能富集分析工具

  • 主要分析内容：

  1. GO功能富集（包括生物过程、细胞组分、分子功能）

  2. KEGG通路富集分析

  3. Reactome通路分析

  • 结果筛选准则：

  1. P值＜0.05（或FDR＜0.05）

  2. 富集基因数≥2

  3. 结合生物学意义筛选关键通路


3.6 “成分-靶点-通路”网络构建

  • 网络整合：将活性成分、核心靶点及关键通路整合为多维交互网络

  • 网络属性分析：

  1. 识别网络中的Hub节点（核心节点）

  2. 解析网络模块结构

  3. 预测关键调控通路


04

实验验证设计（耗时1-2周）





4.1 验证策略制定

  • 体外实验设计：

  1. 选择相关性细胞模型

  2. 确定检测指标（细胞活力、凋亡率、迁移能力、侵袭能力等）

  3. 设计浓度梯度与时间梯度

  • 体内实验设计（根据需求开展）：

  1. 选用合适的动物模型

  2. 制定给药方案与剂量梯度

  3. 规划终点检测指标与样本收集流程


4.2 关键验证实验

  • 细胞毒性/增殖实验：

  1. 采用MTT/CCK-8法检测细胞活力

  2. 通过克隆形成实验评估长期增殖潜力

  • 细胞功能实验：

  1. 运用流式细胞术检测细胞周期分布与凋亡情况

  2. 采用Transwell实验检测细胞迁移与侵袭能力

  3. 利用划痕实验评估细胞迁移能力

  • 分子机制验证：

  1. 采用Western Blot技术检测关键蛋白表达水平

  2. 运用qRT-PCR技术检测基因表达变化

  3. 通过免疫荧光染色观察蛋白定位特征

  • 信号通路验证：

  1. 使用通路特异性抑制剂/激活剂

  2. 检测下游效应分子表达变化

  3. 构建报告基因系统验证通路活性


05

数据整合与机制阐释（耗时2-3周）




5.1 数据整合分析

  • 多层次数据关联：

  1. 建立化学成分与生物活性的关联关系

  2. 对比网络预测结果与实验验证数据

  3. 整合不同实验平台产生的数据

  • 机制通路图绘制：

  1. 利用PathVisio、Cytoscape等工具

  2. 整合化学成分、靶点及通路信息

  3. 标注实验验证结果


5.2 机制假设构建

  • 提出作用机制模型：

  1. 基于网络分析与实验验证结果

  2. 构建多层次作用网络

  3. 阐明多成分-多靶点-多通路协同作用机制

  • 机制创新性分析：

  1. 与现有研究成果进行对比分析

  2. 明确本研究的创新发现

  3. 提出新的科研问题


06

论文撰写与发表（耗时4-6周）





6.1 论文结构规划

标准论文框架：

  • 标题：突出研究创新点与技术特点

  • 摘要：采用结构式摘要（包含研究目的、方法、结果、结论）

  • 引言：阐述研究背景、核心科研问题及研究假设

  • 材料与方法：详细描述实验流程，确保结果可重复

  • 结果：逻辑清晰呈现研究数据，图文互补

  • 讨论：解读研究结果、探讨作用机制、分析研究意义

  • 结论：简明概括核心研究发现

  • 参考文献：格式规范，引用合理


6.2 图表制作要求

  • 质谱图：

  1. 标注关键离子峰与碎片离子

  2. 附带质谱检测条件说明

  3. 包含正负离子模式对比图

  • 网络图：

  1. 以节点颜色、大小区分不同属性

  2. 配备完整图例说明

  3. 标注核心节点

  • 通路图：

  1. 突出本研究涉及的靶点与通路

  2. 采用标准符号与配色方案

  3. 标注调控方向


6.3 投稿策略

  • 期刊选择原则：

  1. 符合研究专业领域与技术特点

  2. 参考同类研究的发表期刊

  3. 综合评估期刊影响因子与审稿周期

  • 常见目标期刊：

Journal of Ethnopharmacology

Phytomedicine

Frontiers in Pharmacology

ACS Omega

Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis

Phytochemistry


07

质量控制与可重复性保障




7.1 数据可重复性措施

  • 原始数据保存：

  1. 留存质谱原始数据（.raw格式）

  2. 归档数据处理参数文件

  3. 保存网络分析输入与输出文件

  • 代码与脚本管理：

  1. 整理R/Python分析脚本

  2. 备份Cytoscape会话文件

  3. 编制数据分析工作流程文档


7.2 方法详细描述要点

  • 质谱方法：详细说明色谱条件、质谱参数及数据采集模式

  • 网络药理学：明确数据库版本、筛选阈值及分析工具版本

  • 实验方法：提供细胞系来源、培养条件及实验步骤细节


7.3 数据共享与伦理规范

  • 数据公开：

  1. 将质谱数据上传至公共数据库（如Metabolights、GNPS）

  2. 提供网络数据的交互式可视化服务

  3. 代码开源至GitHub等平台

  • 研究伦理：

  1. 遵守材料转移协议

  2. 尊重传统知识产权

  3. 符合动物实验伦理标准


08

时间规划




研究阶段

核心内容

预计周期

第一阶段

实验规划与样品制备

1-2周

第二阶段

UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS分析

2-3周

第三阶段

网络药理学分析

2-3周

第四阶段

实验验证设计

1-2周

第五阶段

数据整合与机制阐释

2-3周

第六阶段

论文撰写与发表

4-6周

总计

完整研究周期

12-19周



09

总结与展望





UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS技术与网络药理学的联合应用，为中药及天然产物的现代化研究提供了高效且全面的技术手段。随着分析技术与生物信息学算法的持续迭代升级，该联合研究流程将进一步整合代谢组学、蛋白质组学等多组学数据资源。同时，结合人工智能与机器学习技术的深度应用，有望实现中药活性成分的精准预测、作用靶点的全景式解析及作用机制的智能化阐释，为天然药物的研发提供更广阔的研究视角与更强大的技术支撑，推动中药现代化研究迈向更高水平。


图片
中药鉴定、分子对接、网络药理学等可扫码咨询~~




微信二维码.jpg


分享